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显微镜的七种观察方式

发布人:feinbergmusic.com发布时间:2014/8/15

  1. 明视野观察(Bright field  BF
     
    明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式,广泛应用于病理、检验,用于观察被染色的切片,所有显微镜均能完成此功能。

  2. 暗视野观察(Dark field  DF
     
    暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同,不直接观察到照明的光线,而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此,视场成为黑暗的背景,而被检物体则呈现明亮的象。
     
    暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象,微尘在强光直射通过的情况下,人眼不能观察,这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了体积,为人眼可见。
     
    暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体,而是将光线改变途径,使其斜射向被检物体,使照明光线不直接进入物镜,利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察,最高达0.020.004

  3. 相差镜检法(Phase contrast  PH
     
    在光学显微镜的发展过程中,相差镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本.
     
    相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检,也就是有效地利用光的干涉现象,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察,因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。

     
    相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:
    1.
    环形光阑(annular  diaphragm 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
    2.
    相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:
    1. A+
    相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。
    2. B+
    相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗

    相差观察可分为正相差和负相差
    正相差:适用于物质内部细微结构的观察,黑背景白标本
    负相差:适用于物体形态,数量及活体情况的观察,白背景黑标本
    正相差和负相差主要区别在于,物镜后焦点平面上相差板镀膜不同,所以光透过率不一样;负相差的镜检效果是暗中之明,即被检物体的合成光就比背景明亮,正相差的镜检效果是明中之暗,即被检物体的合成光要比背景暗
    负相差物镜(Negative contrast)用缩写字母“N”表示,正相差物镜(Positive contrast)用缩写字母“P”表示

    四.微分干涉称镜检术(Differential interference contrast  DIC
     
    微分干涉镜检术出现于60年代,它不仅能观察无色透明的物体,而且图象呈现出浮雕壮的立体感,并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点,观察效果更为逼真。
    原理;
     
    微分干涉称镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等,光束分别在距离很近的两点上通过被检物体,在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小,而不出现重影现象,使图象呈现出立体的三维感觉。
     
    DIC
    显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了偌玛斯斯棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(xy),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个偌玛斯斯棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。
    这时两束光的偏振面(xy)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。xy波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕

    .偏光显微镜(Polarizing microscope  POL   
       
    偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨的清楚,当然这些物质也可用染色发来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜。
       
    偏光显微镜的特点,就是将普通改变为偏光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。
    .浮雕相衬显微镜(RC HMC
    1975
    年,Robert Hoffman 博士发明
    2002
    年,专利到期,各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品
    原理
     
    斜射光照射到标本产生折射、衍射,光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影,从而使透明标本表面产生明暗差异,增加观察对比度
    特点
    提高未染色标本的可见性和对比度;
    图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕;
    可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头)
    可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织;
    聚光镜的工作距离可以设计的更长;
    RC
    物镜也可用于明场,暗场和荧光观察
    七:荧光显微镜(Fluorescence Microscopy  FL
     
    荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体,使之受激发后而产生长波长的荧光,然后观察。

    优点:
    检出能力高(放大作用)
    对细胞的刺激小(可以活体染色)
    能进行多重染色
    用途:
    物体构造的观察——荧光素
    荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等
    发荧光量的测定对物质定性、定量分析

     

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